ZANKER ZKF 120 B User Manual

Tunikaten (Ascidiacea) der Nordsee: Chemische Ökologie und pharmakologisches Potential Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Na

90 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 3.12: Epibionten eines Aggregats von Dendrodoa grossularia. sessil/mobil Klasse Art Anzahl** Calcarea (Kalksch

Ergebnisse und Diskussion 91 3.5 Weitere Isolate aus Ascidien Vier weitere Metaboliten wurden aus den untersuchten Ascidien isoliert und aufgeklärt

92 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 3.13: NMR-Daten von Homarin aus Dendrodoa grossularia. No. δ(13C) δ(1H) Molekülgruppe COSY 1H,13C-HMBC 1 161,0

Ergebnisse und Diskussion 93 01020050000100000150000200000250000300000350000400000450000500000TubastrinHomarinLichtintensität [µV] Absorption [µ

94 Ergebnisse und Diskussion N+CH3H3CCH3CH2COO-könnte möglicherweise auch in Ascidien eine Hormon- oder Neurotransmitter-ähnliche Funktion innehaben,

Ergebnisse und Diskussion 95 Synthese von Proteinen stören (Luckner 1984). Pflanzen, halotolerante Cyanobakterien und vestimentifere Röhrenwürmer au

96 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 3.15: NMR-Daten von Adenosin aus der Ascidie Dendrodoa grossularia. No. δ(13C) δ(1H) Molekülgruppe COSY 1H,13

Ergebnisse und Diskussion 97 Inosin sowie vermutlich auch Guanosin sind als Bestandteile eines Pheromoncocktails des männlichen Polychaeten Nereis s

98 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 3.16: NMR-Daten von Inosin aus der Ascidie Ascidiella aspersa. No. δ(13C) δ(1H) Molekülgruppe COSY 1H,13C-HMB

Zusammenfassung 99 4. Zusammenfassung Tunikaten produzieren eine Vielzahl an cytotoxischen und antimikrobiellen Verbindungen, die ihnen in ihrem Öko

Einleitung 1 1. Einleitung Naturstoffe als physiologisch wirksame Bestandteile von Pflanzen und Tieren werden seit Jahrhunderten in allen Kulturen

100 Zusammenfassung geringe cytotoxische Effekte und keine antimikrobiellen Eigenschaften. Als weitere Metaboliten der Ascidien Dendrodoa grossularia

Experimenteller Teil 101 5. Experimenteller Teil Im Folgenden werden die chemischen Methoden, die bei der Extraktion der Ascidien und der Aufreinig

102 Experimenteller Teil Es wurden Dünnschicht-Chromatographie-Fertigplatten aus Glas (Merck DC-Platten 5 × 10 cm RP8 F245s und Merck HPTLC-Platten

Experimenteller Teil 103 Low Pressure Liquid Chromatography (LPLC) Zur Aufreinigung kleinerer Mengen vorgetrennter, polarer Fraktionen diente die LP

104 Experimenteller Teil Quantifizierung von Reinsubstanzen Zur Quantifizierung von Inhaltsstoffen der Ascidie Dendrodoa grossularia wurden definierte

Experimenteller Teil 105 5.2 Nachweis von Guanidingruppen Der Nachweis einer Guanidingruppe in einer Reinsubstanz wurde nach der Anleitung von Aute

106 Experimenteller Teil unpolare, hydrophobe stationäre Phase, als mobile Phase werden stark polare Lösungsmittel eingesetzt. Damit werden polare Sub

Experimenteller Teil 107 Einzig bei der Trennung einiger n-Hexanphasen stellte die RP-Säule einen Vorteil dar. Gegenüber der Diol-Säule wurden die S

108 Experimenteller Teil Tabelle 5.1: Trennungen einzelner Phasen von Ascidiella scabra, Corella parallelogramma und Didemnum candidum. Trennung Meng

Experimenteller Teil 109 Tabelle 5.3: Weitere Auftrennungen der Essigesterphase von Dendrodoa grossularia. Trennung Menge [mg] Methode Säule Laufm

2 Einleitung marinen Proben und der Strukturaufklärung mittels NMR (Munro et al. 1999, Newman et al. 2003). Die Zahl aller auf der Erde lebenden Arte

110 Experimenteller Teil 5.4 Artenvergleich Ascidiella aspersa und Ascidiella scabra 5.4.1 Morphologie Im Mai 2003 wurden auf den Orkney-Inseln 50 I

Experimenteller Teil 111 Eier wurden bei der Präparation meist schon ausgestoßen und konnten im Umkreis des Tieres mit einer Pipette eingesammelt un

112 Experimenteller Teil 5.5 Bioassays 5.5.1 Phytagel-Assay Um Extrakte aus Ascidien und Schwämmen auf ihre besiedlungshemmende Wirkung zu testen, w

Experimenteller Teil 113 2 Replikate). Als Kontrolle diente im ersten Versuch jeweils ein Gel pro Platte, dem ausschließlich 1,5 ml Methanol zugegeb

114 Experimenteller Teil 5.5.2 Antimikrobieller Assay Mit Hilfe des Agar-Diffusions-Assays wurde die antimikrobielle Aktivität von Ascidienextrakten

Experimenteller Teil 115 Tabelle 5.5: Systematische Einordnung und Herkunft der in dem Agar-Diffusions-Test verwendeten Bakterienstämme. Taxonomisch

116 Experimenteller Teil Die Bakterien wurden in Flüssigmedien kultiviert. Zur Testung wurde ein Festagar des entsprechenden Nährmediums in Petrischal

Experimenteller Teil 117 Abbildung 5.4: Ermittlung der Hemmhofbreite über die digitale Auswertung. Foto eines Blättchens des Agar-Diffusions-Tests.

118 Experimenteller Teil Auf die beiden seitlichen Stege wird ein Deckglas aufgelegt, in das Zählnetze eingraviert sind. Dadurch entsteht an den Mitte

Experimenteller Teil 119 (3000 Upm, 5 min) wurde der Überstand ausgeschlagen und die wells zwei Mal mit je 100 µl PBS gespült. Das gebildete Formaza

Einleitung 3 1.1 Systematik und Biologie von Ascidien Tunikaten (Manteltiere) fanden erstmals bei Aristoteles Erwähnung, der den Begriff „THALIA“ f

120 Experimenteller Teil Factor Receptor (EGFR), wurde in Tyrosin-Kinase-Puffer (TK-Puffer) verdünnt. Der Puffer enthält Magnesium, Mangan und ATP. EG

Experimenteller Teil 121 Referenz gewählt und die PTK-Aktivität in den wells mit den Substanzproben und dem Hemmstoff als Restaktivität in Relation

122 Literaturverzeichnis 6. Literaturverzeichnis Aiello A, Carbonelli S, Esposito G, Fattorusso E, Iuvone T & Menna M, 2001a. Turbinamide, a new

Literaturverzeichnis 123 Bandaranayake WM, Bourne DJ & Sim RG, 1997. Chemical composition during maturing and spawning of the sponge Dysidea herb

124 Literaturverzeichnis Blunt JW, Copp BR, Munro MHG, Northcote PT & Prinsep MR, 2004. Marine Natural Products. Natural Products Report 21. 1-49.

Literaturverzeichnis 125 Davis AR, Targett NM, McConnell OJ & Young CM, 1989a. Epibiosis of marine algae and benthic invertebrates: natural produ

126 Literaturverzeichnis Green KM, Russell BD, Clark RJ, Jones MK, Garson MJ, Skilleter GA & Degnan BM, 2002. A sponge allelochemical induces asci

Literaturverzeichnis 127 Issa HH, Tanaka J, Rachmat R & Higa T, 2003. Floresolides, new metacyclophane hydroquinone lactones from an ascidian Apl

128 Literaturverzeichnis Kourany-Lefoll E, Laprévote O, Sévenet T, Montagnac A & Pais M, 1994. Phloeodictines A1-A7 and C1-C2, antibiotic and cyto

Literaturverzeichnis 129 McKee TC, Galinis DL, Pannell LK, Cardellina JH, Laakso J, Ireland CM, Murray L, Capon RJ & Boyd MR, 1998. The lobatamid

4 Einleitung (soziale Arten) oder von einer gemeinsamen Tunika umschlossen (Synascidien). Artspezifische Unterschiede sind in der Färbung, Festigkeit

130 Literaturverzeichnis devices, and its hemolytic and precipitation potential upon i.v. administration. Anti-Cancer Drugs 10. 879-887. Okazaki Y &am

Literaturverzeichnis 131 Rinehart K, Sakai R, Holt TG, Fregeau NL, Perun TJJ, Seigler DS, Wilson GR & Shield LS, 1990a. Biologically active natur

132 Literaturverzeichnis Structure-activity relationships of the didemnins. Journal of Medical Chemistry 39. 2819-2834. Schlegel HG & Zaborosch C,

Literaturverzeichnis 133 Teo SL-M & Ryland J, 1995. Potential antifouling mechanisms using toxic chemicals in some British ascidians. Journal of

134 Literaturverzeichnis Watanabe K, Uehara H, Sato M & Konosu S, 1985. Seasonal variation of extractive nitrogenous constituents in the muscle of

Literaturverzeichnis 135 Zeeck E, Harder T & M. B, 1998. Inosine, L-glutamic acid and L-glutamine as components of a sex pheromone complex of the

136 Abbildungsverzeichnis 7. Abbildungsverzeichnis Abbildung 1.1: Schematische Darstellung einer solitären Ascidie...

Abbildungsverzeichnis 137 Abbildung 3.13: Cytotoxische Aktivität der aufgetrennten Essigesterphase von Dendrodoa grossularia...

138 Abbildungsverzeichnis Abbildung 3.36: Aggregate von Dendrodoa grossularia. ... 89 Abbildu

Tabellenverzeichnis 139 8. Tabellenverzeichnis Tabelle 1.1: Bisher aus den in dieser Arbeit eingesetzten Ascidien isolierte Verbindungen und deren b

Einleitung 5 Abbildung 1.1: Schematische Darstellung einer solitären Ascidie. Schema einer solitären, von einer Tunika umschlossenen Ascidie, die b

140 Tabellenverzeichnis Tabelle 9.1: Übersicht über den Bewuchs der einzelnen Extraktgele im Phytagel-Versuch 1... 168 Tabelle 9.2: Übersicht über den

Anhang 141 9. Anhang 9.1 Beschreibung der bearbeiteten Ascidien Die Darstellung der Arten basiert auf Literaturbeschreibungen (Berrill 1950, Milla

142 Anhang Ascidiella aspersa (Müller, 1776) Biologie Wuchsform Solitär, meist mehrere Individuen in dichten Aggregaten, auch aufeinander wach

Anhang 143 Ascidiella aspersa (Müller, 1776) Chemie ja058, ja183, ja184Ausbeute Probenmenge, getrocknet Rohextrakt n-Hexan Essigester n-Butanol

144 Anhang Ascidiella scabra (Müller, 1776) Biologie Wuchsform Solitär. Verbreitung Irland, Irische See, Großbritannien und Nordsee bis zu den

Anhang 145 Ascidiella scabra (Müller, 1776) Chemie ja101Ausbeute Probenmenge, getrocknet Rohextrakt n-Hexan Essigester n-Butanol Wasser 57,15 g

146 Anhang Ascidia virginea Müller, 1776 Biologie Wuchsform Solitär. Verbreitung Irland, Irische See, Großbritannien, Norwegen. Nördlich bis S

Anhang 147 Ascidia virginea Müller, 1776 Chemie ja102Ausbeute Probenmenge, getrocknet Rohextrakt n-Hexan Essigester n-Butanol Wasser 3,87 g 1,

148 Anhang Ascidia mentula Müller, 1776 Biologie Wuchsform Solitär. Verbreitung Irland, Irische See, Großbritannien, seltener aber a

Anhang 149 Ascidia mentula Müller, 1776 Chemie ja103Ausbeute Probenmenge, getrocknet Rohextrakt n-Hexan Essigester n-Butanol Wasser 30,86 g 8,

6 Einleitung Abbildung 1.2: Stammbaum der Ascidiacea. Systematische Einordnung der in dieser Arbeit untersuchten Ascidienarten in das Phylum Chordat

150 Anhang Aplidium punctum (Giard, 1873) Biologie Wuchsform Koloniebildend. Verbreitung Süd- und Westküste Großbritanniens. Habitat/Substrat S

Anhang 151 Aplidium punctum (Giard, 1873) Chemie ja104/ja116Ausbeute Probenmenge, getrocknet Rohextrakt n-Hexan Essigester n-Butanol Wasser 24,

152 Anhang Botrylloides leachi (Savigny, 1816), Mäander-Seescheide Biologie Wuchsform Koloniebildend. Verbreitung Großbritannien, Nord-Norwegen

Anhang 153 Botrylloides leachi (Savigny, 1816) Chemie ja105Ausbeute Probenmenge, getrocknet Rohextrakt n-Hexan Essigester n-Butanol Wasser 51,0

154 Anhang Botryllus schlosseri (Pallas, 1766), Sternascidie Biologie Wuchsform Koloniebildend. Verbreitung Großbritannien, Nord-Norwegen bis M

Anhang 155 Botryllus schlosseri (Savigny, 1816) Chemie ja106Ausbeute Probenmenge, getrocknet Rohextrakt n-Hexan Essigester n-Butanol Wasser 3,3

156 Anhang Corella parallelogramma (Müller, 1776), Gasmantelascidie Biologie Wuchsform Solitär. Verbreitung Großbritannien, Norwegen bis Mittel

Anhang 157 Corella parallelogramma (Müller, 1776) Chemie ja107Ausbeute Probenmenge, getrocknet Rohextrakt n-Hexan Essigester n-Butanol Wasser 9

158 Anhang Dendrodoa grossularia (van Beneden, 1846), Tangbeere Biologie Wuchsform Solitär, in dichten Aggregaten. Verbreitung Großbritannien

Anhang 159 Dendrodoa grossularia (van Beneden, 1846) Chemie ja108, ja120Ausbeute Probenmenge, getrocknet Rohextrakt n-Hexan Essigester n-Butanol

Einleitung 7 Als sessile Invertebraten mussten Ascidien spezielle Abwehrmechanismen in der Interaktion mit Nachbarorganismen, Fraßfeinden und Epibio

160 Anhang Didemnum candidum Savigny, 1816, “White Sponge Tunicate” Biologie Wuchsform Koloniebildend. Verbreitung West- und Südküste Großbrit

Anhang 161 Didemnum candidum Savigny, 1816 Chemie ja109, ja121Ausbeute Probenmenge, getrocknet Rohextrakt n-Hexan Essigester n-Butanol Wasser 4

162 Anhang Polyclinum aurantium Milne-Edwards, 1841 Biologie Wuchsform Koloniebildend. Verbreitung Großbritannien, West-Norwegen bis Mittelmeer

Anhang 163 Polyclinum aurantium Milne-Edwards, 1841 Chemie ja110Ausbeute Probenmenge, getrocknet Rohextrakt n-Hexan Essigester n-Butanol Wasser

164 Anhang Sidnyum turbinatum Savigny, 1816 Biologie Wuchsform Koloniebildend. Verbreitung Großbritannien, Norwegen bis Mittelmeer. Habitat/Sub

Anhang 165 Sidnyum turbinatum Savigny, 1816 Chemie ja111Ausbeute Probenmenge, getrocknet Rohextrakt n-Hexan Essigester n-Butanol Wasser 24,26 g

166 Anhang Trididemnum cereum (Giard, 1872) Biologie Wuchsform Koloniebildend. Verbreitung Großbritannien. Habitat/Substrat Unterer Gezeitenbe

Anhang 167 Trididemnum cereum (Giard, 1872) Chemie ja112Ausbeute Probenmenge, getrocknet Rohextrakt n-Hexan Essigester n-Butanol Wasser 26,94 g

168 Anhang 9.2 Ergebnisse des Phytagel-Assays Tabelle 9.1: Übersicht über den Bewuchs der einzelnen Extraktgele im Phytagel-Versuch 1. Extrakt Leit

Anhang 169 Tabelle 9.2: Übersicht über den Bewuchs der einzelnen Extraktgele im Phytagel-Versuch 2. Extrakt LeiterBewuchs-grad Balaniden Hydrozoen

8 Einleitung solitäre Ascidien in der Tunika so genannte Blasenzellen, die Schwefelsäure beinhalten (Pirie et al. 1984). Stoecker (1980a, b) zeigte e

170 Anhang 012345678910A. virginea RC. parallelogramma RA. punctum RKontrollenD. candidum RA. scabra RA. mentula RD. grossularia ED. grossularia RD.

Anhang 171 051015202530354045D. candidum RD. grossularia BA. scabra RKontrollenD. grossularia RD. grossularia EA. mentula RC. parallelogramma RA. v

172 Anhang 9.3 Medien und Ergebnisse des antimikrobiellen Assays Tabelle 9.3: Übersicht über die eingesetzten Bakterienstämme. Bakterienstamm DSMZ

Anhang 173 Tabelle 9.4: Zusammensetzung der Nährmedien. 2216E Nr. 1 Nr. 1M Nr. 790 Nr. 67 Nr. 54 Nr. 53 Nr. 97 Nr. 65 Nr. 222 Nr. 607(NH4)

174 Anhang Tabelle 9.5: Ergebnisse des Hemmhoftests Actinobacteria Proteobacteria High GC Low GC α β γ Flavo/ Cytoph. A. Pl. Organismus Gram-posi

Anhang 175 Tabelle 9.6: Ergebnisse des Konzentrationsversuchs. Actinobacteria Proteobacteria High GC Low GC α γ Flavo/ Cytoph. Gram-positive bac

176 Anhang 9.4 Ergebnisse des cytotoxischen Assays Benennung der Proben: ja108/ja120 Dendrodoa grossularia Sammlung 2001/2003 ja109/ja121 Didemnum

Anhang 177 Fortsetzung von Tabelle 9.7. Probe Konz [µg/ml] MIC [µg/ml]ZKF HPLC-Platte Tox [min] MT-Befund ER-Befund ja108/B/L13/D0 1000 nein ne

178 Anhang Fortsetzung von Tabelle 9.7. Probe Konz [µg/ml] MIC [µg/ml]ZKF HPLC-Platte Tox [min] MT-Befund ER-Befund ja109/EE/D1 1000 nein ja

Anhang 179 9.5 Ergebnisse des Protein-Tyrosin-Kinase-Assays In den folgenden Tabellen finden sich die Restaktivitäten des Enzyms [%] bei Inkubation

Einleitung 9 1.2 Naturstoffe aus Ascidien Ascidien sind vor allem auf marinen Hartböden weltweit dominierende Organismen. Ihr Erfolg im inter- als

180 Anhang Tabelle 9.9: Enzymhemmung der aufgetrennten Essigesterphase von Corella parallelogramma, der aufgetrennten n-Hexanphase von Didemnum candi

Anhang 181 Tabelle 9.11: Enzymhemmung der aufgetrennten Essigesterphase von Dendrodoa grossularia (Sammlung 2001). Probe Aktivität (%) Konz. [mg/ml]

182 Anhang Tabelle 9.12: Enzymhemmung in den Konzentrationsversuchen mit verschiedenen Extrakten und Reinsubstanzen. Konzentration [µ/ml] Probe 100

Danksagung 183 Danksagung Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Organische Chemie der Johann Wolfgang Goethe-Universität in Frankfurt am Main

184 Danksagung Gunnar Gerdts und Antje Wichels möchte ich für die wertvollen Ideen und die Unterstützung während der Aufenthalte auf Helgoland danken

Lebenslauf 185 Lebenslauf Jana Stefanie Barenbrock Geburtdatum: 24.03.1974 Frenssenstrasse 52 Geburtsort: Münster 27576 Bremerhaven jbarenbrock

186 Lebenslauf Hochschulstudium 04/1999 – 03/2000 Diplomarbeit in der Abteilung ‚Vergleichende Neurobiologie’ bei Prof. Dr. H. Bleckmann: „Diskri

Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur unter Zuhilfenahme der genannten Literatur un

Barenbrock, Jana S. Tunikaten (Ascidiacea) der Nordsee: Chemische Ökologie und pharmakologisches Potential. vom Fachbereich Chem

10 Einleitung OONNCH3NHH3COCH3COH3COHOHOOCH3CH3OHOOS Abbildung 1.3: Strukturformel von Ecteinascidin 743 (1). Ecteinascidin wurde aus der Ascidie Ect

Einleitung 11 CHNCCHNHCCHCCHOCH2CHNCCHCHOCHCNCOCHHC(CH3)2HCOCH3O(CH3)2CHCH2OOH3CCH2CH2H2CH2COCH3OH3CNHOCHOHCCHOCH2CH(CH3)2NH3CONOOHCH2CH3H3C Abbildu

12 Einleitung langfristig die aufwändige und ertragsarme Extraktion des Wirkstoffes aus Ascidien abgelöst werden können (Corey et al. 1996, Martinez

Einleitung 13 Tabelle 1.1: Bisher aus den in dieser Arbeit eingesetzten Ascidien isolierte Verbindungen und deren biologische Wirkung. Struktur W

14 Einleitung NHOSNNNH3CCH3 NHNNONOCH3CH3 NHNNHNNCH3H3CONH NHNNHNNCH3H3COOH Abbildung 1.6: Dendrodoin (3) und Alboinon (4) sowie die Grossularine 1

Einleitung 15 1.3 Zielsetzung der Arbeit Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Ascidien der Nordsee auf ihre biologisch-chemischen Eigenschaften und

16 Methoden 2. Methoden 2.1 Materialsammlung Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Ascidienarten wurden während zweier Forschungsfahrten der FS

Methoden 17 Zusätzlich zu den Proben von den Orkney-Inseln konnten Extrakte der Art Ascidiella aspersa getestet werden, die aus einem BMBF-Projekt (

18 Methoden werden von sessilen Filtrierern wie Schwämmen, Tunikaten, Hydrozoen, Bryozoen und Balaniden dominiert. An mobilen Arten sind Nackt- und G

Methoden 19 Tauchplatz 1: Tuquoy Bay, Westray Die Tuquoy Bay (Abbildung 2.2) liegt an der südöstlichen Seite der Insel Westray. Sie ist damit sehr g

20 Methoden Tauchplatz 2: Red Nev Das Gebiet Red Nev bezeichnet die Westseite der Insel Westray und liegt in einem starken Strömungs-, Wellen- und Ge

Methoden 21 Tauchplatz 3: Saviskaill Bay Die Saviskaill Bay (Abbildung 2.6) liegt im Norden der Insel Rousay. Sie bildet die südliche Begrenzung des

22 Methoden 2.2.2 Helgoland und Doggerbank Die Nordsee hat als typisches Schelfmeer eine mittlere Tiefe von 70 Metern. Der Meeresboden der südlichen

Methoden 23 Die Doggerbank liegt etwa auf Höhe der mittelenglischen Grafschaft Yorkshire und erstreckt sich Richtung Jütland und Skagerrak (Abbildun

24 Methoden 2.3 Chemische Methoden 2.3.1 Extraktion Die gesammelten Organismen wurden in gefrorenem Zustand in einer Gefriertrocknungsanlage vollst

Methoden 25 2.3.2 Chromatographische Methoden Die durch die Extraktion gewonnenen Substanzgemische wurden mit Hilfe von verschiedenen chromatograph

26 Methoden 2.4 Artenvergleich Ascidiella aspersa und Ascidiella scabra Die systematische Einordnung von Ascidiella aspersa und Ascidiella scabra is

Methoden 27 2.5.1 Phytagel-Assay Ascidien besitzen je nach Art unterschiedlich starken Aufwuchs. Es konnten dabei Unterschiede im epibiontischen Be

28 Methoden Die Schwimmbadmole ist eine Betonbefestigung an der östlichen Seite der Insel. Sie zeichnet sich durch ihren dichten Bewuchs mit Algen un

Methoden 29 2.5.2 Antimikrobieller Assay Die antimikrobielle Aktivität von Ascidienextrakten wurde mit Hilfe des Agar-Diffusions-Assays geprüft. De

30 Methoden 2.5.3 Cytotoxischer Assay Die im antimikrobiellen Assay getesteten Proben wurden auf ihre cytotoxische Wirkung auf Mausfibroblasten unte

Methoden 31 2.5.4 Protein-Tyrosin-Kinase-Assay Der Protein-Tyrosin-Kinase-Assay stellt ein Testsystem dar, in dem Substanzgemische und Reinsubstanz

32 Ergebnisse und Diskussion 3. Ergebnisse und Diskussion Die beschriebenen Versuche wurden während des Zeitraums der Arbeit parallel durchgeführt. M

Ergebnisse und Diskussion 33 morphologischen Einordnung. Andererseits konnten mit den neuen Methoden auch unsichere systematische Verwandtschaftsbez

34 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.2: Schema zur Vermessung der äußeren Morphologie. Darstellung der Parameter, die zum Vergleich der äußeren M

Ergebnisse und Diskussion 35 010203040506070010203040506070 Anzahl Körpermaße [mm]Longitud.GefäßeOraleTentakelSiphon-öffnungenbSiphoneaBreiteLänge A

36 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.4: Morphologische Merkmale von Ascidiella aspersa und Ascidiella scabra. Literaturbeschreibung der äußeren M

Ergebnisse und Diskussion 37 Als Unterscheidungskriterium von systematischem Rang wurde die Morphologie der Eier betrachtet (Abbildung 3.4). Die Eie

38 Ergebnisse und Diskussion 01020020000040000060000080000010000001200000Lichtintensität [µV]Retentionszeit [min] 010200200000400000600000800000100000

Ergebnisse und Diskussion 39 Sequenzen meist erst bei fern verwandten Arten auftreten (White et al. 1990, Coleman et al. 1997). Der Sequenzvergleich

40 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.8: Eine der Phytagel-Platten vor und nach der Inkubation. Zu sehen ist eine der Phytagel-Platten mit zwö

Ergebnisse und Diskussion 41 wiederholt, wobei die Gele in Abständen von drei bis sechs Tagen begutachtet wurden, um den Fortgang des Bewuchses zu k

42 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 3.1: Algendichte und Anzahl der sessilen bzw. assoziierten Epibionten der Extraktgele der Versuche 1 und 2. Vers

Ergebnisse und Diskussion 43 Der sprunghafte Anstieg des Balanidenbesatzes sowie das Auftreten der neuen Arten im zweiten Versuch machen deutlich, d

44 Ergebnisse und Diskussion 0510152025303540455055Versuch 2Versuch 1Kat. 3Kat. 2Kat. 1Kat. 4Kat. 3Kat. 2Kat. 1Anzahl Organismen Abbildung 3.9: Anzahl

Ergebnisse und Diskussion 45 3.2.2 Antimikrobieller Assay Mit dem Agar-Diffusions-Assay sollten antimikrobielle Effekte der Ascidienextrakte nachge

46 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 3.2: Anzahl der durch jede Ascidienart gehemmten Bakterienstämme. Art Gehemmte Bakterienstämme Ascidiella scabra

Ergebnisse und Diskussion 47 drei Ascidienarten ausschließlich marine Bakterien, dass aber insgesamt mehr marine als terrestrische Bakterienstämme i

48 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 3.3: Anzahl der die jeweiligen Bakterienstämme hemmenden Ascidienarten. Organismus * Aktive Ascidien Gram-positi

Ergebnisse und Diskussion 49 Tabelle 3.4: Bewertung der ausgemessenen Hemmhöfe nach ihrer Breite. Actinobacteria Proteobacteria High GC Low GC α β

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung ...

50 Ergebnisse und Diskussion Bakterien sind die ersten Organismen, die eine freie Oberfläche im marinen Habitat kolonisieren. Der resultierende Biofil

Ergebnisse und Diskussion 51 Einige Bakterienstämme induzierten verstärktes Wachstum oder Verfärbungen der Bakterienkolonien. Extrakte von Ascidiell

52 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.11: Durch Inkubation mit Ascidienextrakten verfärbte Bakterienkolonien. Gelb (a) bzw. rosa (b) gefärb

Ergebnisse und Diskussion 53 et al. 1989b, Teo et al. 1994, Ramasamy et al. 2003). Auffällige Unterschiede in diesen Versuchen sind die beobachteten

54 Ergebnisse und Diskussion 3.2.3 Cytotoxischer Assay Cytotoxische Aktivität von Ascidienextrakten ist seit langem bekannt. Die Arten Didemnum molle

Ergebnisse und Diskussion 55 Tabelle 3.5: Cytotoxische Aktivität der untersuchten Ascidien. Art aktive Phase Sammlung 2001 Sammlung 2003 Ascidia

56 Ergebnisse und Diskussion charakteristische Organellen angefärbt. Es ergaben sich bei Extrakten aus den Ascidien Dendrodoa grossularia und Didemnum

Ergebnisse und Diskussion 57 3.2.3.1 Auftrennung der n-Hexanphase von Aplidium punctum Die n-Hexanphase von Aplidium punctum wurde über präparativ

58 Ergebnisse und Diskussion 3.2.3.2 Weitere Auftrennung der Essigesterphase von Dendrodoa grossularia Die Essigesterphase von Dendrodoa grossularia

Ergebnisse und Diskussion 59 Apoptose sind unter anderem die Kondensation der genomischen DNS zu einer sichelförmigen Masse an der Zellkernperipheri

Inhaltsverzeichnis 3.4.4 Zusammenfassung der biologischen Aktivität von Dendrodoa grossularia.. 88 3.5 Weitere Isolate aus Ascidien ...

60 Ergebnisse und Diskussion Normale Zellmorphologie Morphologische Veränderungen ER und Zellkerne sichelförmige Zellkerne Mitosespindel multipol

Ergebnisse und Diskussion 61 3.2.3.3 Auftrennung des Essigesterextraktes von Didemnum candidum Die Essigesterphase von Didemnum candidum wurde durc

62 Ergebnisse und Diskussion im ER benötigen, nicht stattfinden. Vakuolen mit Abbauprodukten akkumulieren daher im ER. Bei einer Untersuchung der akti

Ergebnisse und Diskussion 63 sichelzellförmigeZellkernemultipolareMitosespindelnCentrosomensichtbar17 FraktionenEssigesterphaseD. grossulariaalle Fr

64 Ergebnisse und Diskussion 3.2.4 Protein-Tyrosin-Kinase-Assay Mit dem Protein-Tyrosin-Kinase-Assay können enzymhemmende Eigenschaften von natürlich

Ergebnisse und Diskussion 65 Tabelle 3.6: Aktivität des EGFR bei Inkubation mit Extrakten von zwölf Ascidienarten der Sammlung 2001. Art Rohextrakt

66 Ergebnisse und Diskussion 3.2.4.1 Moderate Inhibition: Auftrennung der Fraktionen und Sammlung 2003 Die drei moderat aktiven Fraktionen der Arten

Ergebnisse und Diskussion 67 nachweisbar. Die zuvor beobachtete Wirkung scheint daher kein kontinuierlicher Effekt zu sein, sondern könnte mit der H

68 Ergebnisse und Diskussion Die weitere Auftrennung beider Fraktionen wurde durch PTK-Assays begleitet. So konnte die Aktivität verfolgt und die weit

Ergebnisse und Diskussion 69 Dendrodoa grossularia wurden im Phytagel-Versuch gar nicht von Invertebraten besiedelt, ließen aber nur sehr schwache a

70 Ergebnisse und Diskussion sich die Frage, inwiefern Ascidien der Nordsee überhaupt Substanzen zum Fraßschutz synthetisieren müssen, da gemeinhin de

Ergebnisse und Diskussion 71 3.4 Isolierung von Reinsubstanzen aus Dendrodoa grossularia 3.4.1 Bioassay-guided Fractionation Die enzyminhibierende

72 Ergebnisse und Diskussion Abbildung 3.19: 1H-NMR-Spektren der aktiven Fraktionen aus der n-Butanolphase von Dendrodoa grossularia. Das Spektrum de

Ergebnisse und Diskussion 73 15 Fraktionenn-Butanolphase9 Hauptfraktionen1 Fraktioninaktiv4 Fraktionenmoderat hemmend8 Fraktionenstark hemmend2 Fra

74 Ergebnisse und Diskussion 3.4.1.2 Fraktionierung der Essigesterphase Die Auftrennung der Essigesterphase über Größenausschlußchromatographie ergab

Ergebnisse und Diskussion 75 0 5 10 15 20 2502000004000006000008000001000000 Lichtintensität [µV]Retentionszeit [min] 020000040000060000080000010

76 Ergebnisse und Diskussion 17 FraktionenEssigesterphase1 Fraktioninaktiv2 Fraktionenmoderat hemmend14 Fraktionenstark hemmend12 Hauptfraktionen1 Fra

Ergebnisse und Diskussion 77 3.4.2 Identifizierung des EGFR-Inhibitors Tubastrin Über HR-ESI-MS der Substanz EL10X3 wurde C9H11N3O2 (m/z = 194,0922

78 Ergebnisse und Diskussion Die Stickstoffatome wurden in einer Guanidingruppe vermutet, die über einen Sakaguchi-Test (Auterhoff et al. 1977) nachge

Ergebnisse und Diskussion 79 Sakaguchi-Reaktion mit einem aus einem Schwamm isolierten Tubastrin-Derivat (Urban et al. 1994, Abbildung 3.28) angesic

Abkürzungen Abkürzungen ANOVA Analysis of Variance ATP Adenosin-Triphosphat COSY Correlated Spectroscopy δ chemische Verschiebung (in ppm) DAPI

80 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 3.8: NMR-Daten von Tubastrin aus der Koralle Tubastrea aurea a) (Sakai et al. 1987) und der Ascidie Dendrodoa gro

Ergebnisse und Diskussion 81 HOHOHNNH2HHNH1234567891011 HNNH2HHNH2HOCl- Abbildung 3.28: Strukturformeln von Tubastrin (7) und einem Tubastrin-Deriv

82 Ergebnisse und Diskussion Tabelle 3.9: IR-Daten von Tubastrin aus Dendrodoa grossularia im Vergleich zu den Literaturwerten von Sakai et al. (1987)

Ergebnisse und Diskussion 83 MS/MS-Spektrometrie führte zu Fragmenten von m/z = 152 [M-CH2N2]+, 135 [M-CH5N3]+ und 107 [M-C2H5N3O]+ (Abbildung 3.30)

84 Ergebnisse und Diskussion Ein Konzentrationsversuch ergab einen IC50-Wert von Tubastrin von 34,6 µg/ml (179,2 µM). Tubastrin zeigte damit eine deut

Ergebnisse und Diskussion 85 Ein weiterer in der Struktur ähnlicher EGFR-Hemmstoff ist das aus einem Actinomyceten isolierte Erbstatin. Der IC50-Wer

86 Ergebnisse und Diskussion Obwohl der 3,4-Dihydroxyphenylrest als auch die zentrale Doppelbindung bei Tubastrin vorhanden sind, liegt die Hemmwirkun

Ergebnisse und Diskussion 87 3.4.3 Physiologische und ökologische Bedeutung von PTK-beeinflussenden Substanzen Protein-Tyrosin-Kinasen (PTKs) bilde

88 Ergebnisse und Diskussion 3.4.4 Zusammenfassung der biologischen Aktivität von Dendrodoa grossularia Extrakte aus Dendrodoa grossularia waren in a

Ergebnisse und Diskussion 89 Abbildung 3.36: Aggregate von Dendrodoa grossularia. Das Lineal dient als Referenz für die Größe der Aggregate, deren